Войти
Т-лимфоциты рецептора химерного антигена (также известные как Т-клетки CAR ): Т-клетки, которые были генетически сконструированы для производства искусственного Т-клеточного рецептора для использования в иммунотерапии.
Химерные антигенные рецепторы (CARs, также известные химерные иммунорецепторы, химерные Т-клеточные рецепторы или искусственные Т-клеточные рецепторы ) представляют собой рецепторные белки, которые были разработаны, чтобы давать Т-клетки - новая способность нацеливаться на конкретный белок. Рецепторы являются химерными, поскольку они сочетают в себе функции связывания антигена и активации Т-клеток в одном рецепторе.
CAR-T клеточная терапия использует Т-клетки, сконструированные с использованием CAR для лечения рака. Предпосылка иммунотерапии CAR-T состоит в том, чтобы модифицировать Т-клетки для распознавания раковых клеток с целью более эффективного нацеливания и уничтожения их. Ученые собирают Т-клетки у людей, генетически изменяют их, а затем вводят полученные CAR-Т-клетки пациентам, чтобы атаковать их опухоли. CAR-T-клетки могут происходить либо из Т-клеток собственной крови пациента (аутологичные ), либо происходить из Т-клеток другого здорового донора (аллогенные ). После выделения от человека эти Т-клетки генетически сконструированы для экспрессии определенного CAR, который программирует их нацеливание на антиген, присутствующий на поверхности опухолей. В целях безопасности, CAR-T-клетки сконструированы так, чтобы быть специфичными к антигену, экспрессированному в опухоли, который не экспрессируется на здоровых клетках.
После того, как CAR-T-клетки вводятся пациенту, они действуют как «живые» препарат "против раковых клеток". Когда они вступают в контакт со своим целевым антигеном на клетке, клетки CAR-T связываются с ним и активируются, а затем продолжают пролиферировать и становятся цитотоксическими. CAR-T-клетки разрушают клетки с помощью нескольких механизмов, включая экстенсивную стимулированную пролиферацию клеток, повышение степени их токсичности для других живых клеток (цитотоксичность) и увеличение секреции факторов, которые могут влиять на другие клетки, таких как цитокины , интерлейкины и факторы роста.
Описание адоптивной терапии клеточного переноса с Т-клетками, созданными с помощью CAR Первый шаг в производстве CAR-T-клетки - это выделение Т-клеток из крови человека. CAR-T-клетки могут быть получены либо из собственной крови пациента, известной как аутологичное лечение, либо из крови здорового донора, известного как аллогенное лечение. В обоих случаях производственный процесс одинаков; отличается только выбор первоначального донора крови.
Сначала лейкоциты выделяют с использованием сепаратора клеток крови в процессе, известном как аферез лейкоцитов. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) затем отделяют и собирают. Затем продукты лейкоцитарного афереза переносятся в центр обработки клеток. В центре обработки клеток стимулируются специфические Т-клетки, так что они активно размножаются и увеличиваются в размерах. Чтобы стимулировать их рост, Т-клетки обычно обрабатывают цитокином интерлейкином 2 (IL-2) и анти- CD3 антителами.
. размноженные Т-клетки очищают и затем трансдуцируют геном, кодирующим сконструированный CAR с помощью ретровирусного вектора, обычно либо интегрирующего гаммаретровируса (RV), либо лентивирусный (LV) вектор. Эти векторы очень безопасны в наше время из-за частичного удаления области U3. Новый инструмент редактирования генов недавно был использован вместо ретровирусных векторов для интеграции гена CAR в определенные участки генома.
Пациент подвергается лимфодеплеции химиотерапии перед введением сконструированного CAR -Т клетки. Истощение количества циркулирующих лейкоцитов у пациента увеличивает количество продуцируемых цитокинов и снижает конкуренцию за ресурсы, что способствует увеличению количества сконструированных CAR-T-клеток.
На приведенной выше диаграмме показан процесс Т-клеточной терапии химерного антигенного рецептора (CAR), это метод иммунотерапии, который становится все более распространенной практикой в лечении рака. Конечным результатом должно быть производство оснащенных Т-клеток, которые могут распознавать инфицированные раковые клетки в организме и бороться с ними.. 1. Т-клетки (представленные объектами, обозначенными как ’t’) удаляются из крови пациента.. 2. Затем в лабораторных условиях ген, который кодирует специфические рецепторы антигена, внедряется в Т-клетки.. 3. Таким образом продуцируя рецепторы CAR (обозначенные как c) на поверхности клеток.. 4. Затем вновь модифицированные Т-клетки собирают и выращивают в лаборатории.. 5. По прошествии определенного периода времени сконструированные Т-клетки снова вводятся пациенту. Т-клетки генетически сконструированы для экспрессии химерных антигенных рецепторов, специфически направленных на антигены на опухолевых клетках пациента, затем вводятся пациенту, где они атакуют и убивают раковые клетки. Адоптивный перенос Т-клеток, экспрессирующих CAR, является многообещающим противораковым терапевтическим средством, потому что CAR-модифицированные Т-клетки могут быть сконструированы для воздействия практически на любой ассоциированный с опухолью антиген.
Ранний CAR -Исследования Т-клеток сосредоточены на раке крови. В первых одобренных методах лечения используются CAR, нацеленные на антиген CD19, присутствующий в B-клеточных -производных раковых заболеваниях, таких как острый лимфобластный лейкоз (ALL) и диффузная крупноклеточная B-клеточная лимфома (DLBCL). Также предпринимаются усилия по созданию CAR, нацеленных на многие другие антигены рака крови, включая CD30 при рефрактерной лимфоме Ходжкина ; CD33, CD123 и FLT3 в остром миелоидном лейкозе (AML); и BCMA в множественной миеломе.
солидные опухоли представляют собой более трудную мишень. Идентификация хороших антигенов была сложной задачей: такие антигены должны сильно экспрессироваться на большинстве раковых клеток, но в значительной степени отсутствовать в нормальных тканях. CAR-T-клетки также не доставляются эффективно в центр солидных опухолевых масс, а враждебное опухолевое микроокружение подавляет активность Т-клеток.
Первые два препарата CAR-T, одобренные FDA, нацелены на антиген CD19, который обнаруживается при многих типах В-клеточного рака. Tisagenlecleucel (Kymriah / Novartis ) одобрен для лечения рецидивирующего / рефрактерного предшественника В-клеток острого лимфобластного лейкоза (ALL), а аксикабтаген цилолейцель (Yescarta / Kite Pharma ) одобрен для лечить рецидивирующую / рефрактерную диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL).
По состоянию на март 2019 года во всем мире проводилось около 364 клинических испытаний с участием CAR-T-клеток. Большинство этих исследований нацелены на рак крови: на лечение CAR-T приходится более половины всех исследований гематологических злокачественных новообразований. CD19 по-прежнему является наиболее популярной антигенной мишенью, за ним следует ВСМА (обычно экспрессируется в множественной миеломе ). В 2016 году начались исследования по изучению жизнеспособности других антигенов, таких как CD20. В исследованиях солидных опухолей в меньшей степени доминирует CAR-T, при этом около половины исследований, основанных на клеточной терапии, включают другие платформы, такие как NK-клетки.
, хотя начальные показатели клинической ремиссии после терапии CAR-T-клетками у всех пациентов составляют достигая 90%, долгосрочная выживаемость намного ниже. Причиной обычно является появление лейкозных клеток, которые не экспрессируют CD19 и поэтому ускользают от распознавания CD19-CAR Т-клетками, явление, известное как ускользание от антигена. Доклинические исследования по разработке CAR-T-клеток с двойным нацеливанием на CD19 плюс CD22 или CD19 плюс CD20 продемонстрировали многообещающие результаты, и испытания, изучающие биспецифическое нацеливание для обхода подавления CD19, продолжаются.
Введение CAR-T-клеток в организм вызывает серьезные побочные эффекты, в том числе синдром высвобождения цитокинов и неврологическую токсичность. Поскольку это относительно новый метод лечения, имеется мало данных о долгосрочных эффектах терапии CAR-T-клетками. По-прежнему существуют опасения по поводу долгосрочной выживаемости пациентов, а также осложнений беременности у пациенток, получавших CAR-T-клетки.
Наиболее частой проблемой после лечения CAR-T-клетками является синдром высвобождения цитокинов (CRS) состояние, при котором иммунная система активируется и высвобождает повышенное количество воспалительных цитокинов. Клиническое проявление этого синдрома напоминает сепсис с высокой температурой, утомляемостью, миалгией, тошнотой, утечкой капилляров, тахикардией и другими нарушениями функции сердца, печеночной недостаточностью и почечной недостаточностью. обесценение. CRS встречается почти у всех пациентов, получавших терапию CAR-T-клетками; Фактически, присутствие CRS является диагностическим маркером, который указывает на то, что клетки CAR-T работают так, как предназначены для уничтожения раковых клеток. Обратите внимание, однако, что более высокая степень тяжести CRS не коррелирует с повышенным ответом на лечение, а скорее с более высоким бременем заболевания.
Неврологическая токсичность также часто связана с лечением CAR-T-клетками. Основной механизм плохо изучен и может быть связан или не связан с CRS. Клинические проявления включают делирий, частичную потерю способности связно говорить при сохранении способности интерпретировать речь (экспрессивная афазия ), снижение внимания (затупление ) и судороги. Во время некоторых клинических испытаний имели место случаи смерти из-за нейротоксичности. Основная причина смерти от нейротоксичности - отек мозга. В исследовании, проведенном Juno Therapeutics, Inc., пять пациентов, участвовавших в исследовании, умерли в результате отека мозга. Двое из пациентов лечились только циклофосфамидом, а остальные трое лечились комбинацией циклофосфамида и флударабина. В другом клиническом исследовании, спонсируемом Онкологическим исследовательским центром Фреда Хатчинсона, был зарегистрирован один случай необратимой и фатальной неврологической токсичности через 122 дня после введения CAR-T-клеток.
Анафилаксия - это заболевание. ожидаемый побочный эффект, поскольку CAR образуется с чужеродным моноклональным антителом и, как следствие, вызывает иммунный ответ.
Распознавание на мишени / вне опухоли происходит, когда CAR-T-клетка распознает правильный антиген, но антиген экспрессируется в здоровой непатогенной ткани. Это приводит к тому, что CAR-T-клетки атакуют неопухолевые ткани, такие как здоровые В-клетки, экспрессирующие CD19. Тяжесть этого побочного эффекта может варьироваться от В-клеточной аплазии, которую можно лечить поддерживающими инфузиями, до крайней токсичности, приводящей к смерти.
Также маловероятно, что инженерные CAR-T-клетки сами превращаются в раковые клетки посредством инсерционного мутагенеза из-за того, что вирусный вектор вставляет ген CAR в опухолевый супрессор или онкоген в геном Т-хозяина. Некоторые ретровирусные (RV) векторы несут меньший риск, чем лентивирусные (LV) векторы. Однако оба они могут быть онкогенными. Анализ геномного секвенирования сайтов встраивания CAR в Т-клетки был разработан для лучшего понимания функции и устойчивости CAR Т-клеток in vivo.
Рецепторы химерного антигена сочетают в себе многие аспекты нормального Активация Т-клеток в один белок. Они связывают внеклеточный антиген домен узнавания с внутриклеточным сигнальным доменом, который активирует Т-лимфоциты, когда антиген связывается. CAR состоят из четырех областей: домена распознавания антигена, внеклеточной шарнирной области, трансмембранного домена и внутриклеточного T-клеточного сигнального домена.
Различные компоненты искусственного TCR Домен распознавания антигена экспонируется снаружи клетки в эктодоменной части рецептора. Он взаимодействует с потенциальными молекулами-мишенями и отвечает за нацеливание CAR-T-клетки на любую клетку, экспрессирующую подходящую молекулу.
Домен распознавания антигена обычно происходит из вариабельных областей моноклонального антитела, связанных вместе в виде одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv). ScFv представляет собой химерный белок, состоящий из легкой (V L) и тяжелой (V H) цепей иммуноглобинов, связанных с коротким линкерным пептидом. Эти области V L и V H выбирают заранее по их способности связываться с антигеном-мишенью (таким как CD19). Линкер между двумя цепями состоит из гидрофильных остатков с участками глицина и серина в нем для гибкости, а также участками глутамата и лизин для дополнительной растворимости. Однодоменные антитела (например, V H, V H H) были сконструированы и разработаны как домены распознавания антигена в формате CAR из-за их высокой эффективности трансдукции в Т-клетки.
В дополнение к фрагментам антител для определения специфичности CAR также использовались подходы, не основанные на антителах, обычно с использованием пар лиганд / рецептор, которые обычно связываются друг с другом. Цитокины, рецепторы врожденного иммунитета, рецепторы TNF, факторы роста и структурные белки успешно используются в качестве доменов узнавания антигена CAR.
Шарнир, также называемый спейсером, представляет собой небольшой структурный домен, который находится между областью распознавания антигена и внешней мембраной клетки. Идеальный шарнир увеличивает гибкость головки рецептора scFv, уменьшая пространственные ограничения между CAR и его антигеном-мишенью. Это способствует связыванию антигена и образованию синапсов между CAR-T-клетками и клетками-мишенями. Шарнирные последовательности часто основаны на проксимальных к мембране областях других иммунных молекул, включая IgG, CD8 и CD28.
трансмембранный домен представляет собой структурный компонент, состоящий из гидрофобной альфа-спирали, которая охватывает клеточную мембрану. Он прикрепляет CAR к плазматической мембране, соединяя внеклеточный шарнир и домены распознавания антигена с внутриклеточной сигнальной областью. Этот домен важен для стабильности рецептора в целом. Обычно используется трансмембранный домен из наиболее проксимального к мембране компонента эндодомена, но разные трансмембранные домены приводят к разной стабильности рецептора. Известно, что трансмембранный домен CD28 дает высокоэкспрессируемый стабильный рецептор.
Использование трансмембранного домена CD3-zeta не рекомендуется, поскольку это может привести к включению искусственного TCR в нативный TCR.
Домен передачи сигналов внутриклеточных Т-клеток лежит в эндодомене рецептора внутри клетки. После связывания антигена с внешним доменом распознавания антигена рецепторы CAR объединяются в кластеры и передают сигнал активации. Затем внутренний цитоплазматический конец рецептора поддерживает передачу сигналов внутри Т-клетки.
Нормальная активация Т-клеток зависит от фосфорилирования иммунорецепторных тирозиновых мотивов активации (ITAM), присутствующих в цитоплазматическом домене. из CD3-дзета. Чтобы имитировать этот процесс, цитоплазматический домен CD3-zeta обычно используется в качестве основного компонента эндодомена CAR. Также были опробованы другие ITAM-содержащие домены, но они не столь эффективны.
Т-клеткам также необходимы костимулирующие молекулы в дополнение к передаче сигнала CD3, чтобы они сохранялись после активации. По этой причине эндодомены рецепторов CAR обычно также включают один или несколько химерных доменов костимулирующих белков. Были успешно протестированы сигнальные домены из широкого спектра костимулирующих молекул, включая CD28, CD27, CD134 (OX40) и CD137 ( 4-1BB).
Изображение химерных антигенных рецепторов первого, второго и третьего поколений с сегментами scFv зеленым цветом, а различные компоненты передачи сигналов TCR - красным, синим и желтым. Первое CAR-T-клетки были разработаны в 1987 году Йошиказу Кувана и соавт. за ними в 1989 г. последовали Гидеон Гросс и Зелиг Эшхар в Институте Вейцмана, Израиль. Сложность сконструированных рецепторов CAR со временем выросла, и в зависимости от их состава их называют CAR первого, второго, третьего или четвертого поколения.
CAR первого поколения состоят из внеклеточного связывающего домена, шарнирной области, трансмембранного домена и одного или нескольких доменов внутриклеточной передачи сигналов. Внеклеточный связывающий домен содержит одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), полученный из опухолевых антиген-реактивных антител, который обычно имеет высокую специфичность к определенному опухолевому антигену. Все CAR содержат домен цепи CD3ζ в качестве внутриклеточного сигнального домена, который является первичным передатчиком сигналов активации Т-клеток.
CAR второго поколения добавляют костимулирующий домен, такой как CD28 или 4-1BB. Участие этих внутриклеточных сигнальных доменов улучшает пролиферацию Т-клеток, секрецию цитокинов, устойчивость к апоптозу и устойчивость in vivo.
CAR третьего поколения объединяют несколько костимулирующих доменов, таких как CD28-41BB или CD28-OX40, для увеличения активности Т-клеток. Доклинические данные показывают, что CAR третьего поколения демонстрируют улучшенные эффекторные функции и лучшую устойчивость in vivo по сравнению с CAR второго поколения.
CAR четвертого поколения (также известные как TRUCK или бронированные CAR) дополнительно добавляют факторы, которые усиливают Т-клетки расширение, стойкость и противоопухолевое действие. Сюда могут входить цитокины, такие как ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-12 и костимулирующие лиганды.
в 2018 г. была версия CAR. разработан, называемый SUPRA CAR, или раздельный, универсальный и программируемый. Можно использовать несколько механизмов для точного регулирования активности SUPRA CAR, что ограничивает чрезмерную активацию. В отличие от традиционной конструкции CAR, SUPRA CAR позволяет воздействовать на несколько антигенов без дальнейшей генетической модификации иммунных клеток человека.
Добавление синтетического механизма контроля к сконструированным Т-клеткам позволяет врачам для точного контроля устойчивости или активности Т-клеток в организме пациента с целью снижения токсических побочных эффектов. Основные методы контроля вызывают гибель Т-клеток или ограничивают активацию Т-клеток и часто регулируют Т-клетки с помощью отдельного препарата, который можно вводить или отменять по мере необходимости.
Гены-самоубийцы: Генетически модифицированные Т-клетки сконструированы таким образом, чтобы включать один или несколько генов, которые могут индуцировать апоптоз при активации внеклеточной молекулой. Вирус простого герпеса тимидинкиназа (HSV-TK) и индуцибельная каспаза 9 (iCasp9) представляют собой два типа суицидных генов, которые были интегрированы в клетки CAR-T. В системе iCasp9 комплекс суицидных генов состоит из двух элементов: мутировавшего FK506-связывающего белка с высокой специфичностью по отношению к небольшой молекуле римидуцида / AP1903 и гена, кодирующего человеческую каспазу 9 с удаленным продоменом. Дозирование пациента римидуцидом активирует система самоубийства, ведущая к быстрому апоптозу генетически модифицированных Т-клеток. Хотя обе системы HSV-TK и iCasp9 демонстрируют заметную функцию предохранительного переключателя в клинических испытаниях, некоторые дефекты ограничивают их применение. HSV-TK происходит от вируса и может быть иммуногенным для человека. Также в настоящее время неясно, будут ли стратегии суицидных генов действовать достаточно быстро во всех ситуациях, чтобы остановить опасную цитотоксичность вне опухоли.
Рецептор с двойным антигеном: CAR-T-клетки сконструированы для одновременной экспрессии двух связанных с опухолью антигенных рецепторов, что снижает вероятность того, что Т-клетки будут атаковать неопухолевые клетки. Сообщалось, что клетки CAR-T с двойным антигеном имеют менее выраженные побочные эффекты. Исследование in vivo на мышах показывает, что клетки с двойным рецептором CAR-T эффективно исключают рак простаты и обеспечивают полное долгосрочное выживание.
Переключатель ON: В этой системе клетки CAR-T могут функционировать только в наличие как опухолевого антигена, так и доброкачественной экзогенной молекулы. Чтобы достичь этого, сконструированный рецептор химерного антигена CAR-T-клетки разделяется на два отдельных белка, которые должны объединиться, чтобы функционировать. Первый рецепторный белок обычно содержит внеклеточный антигенсвязывающий домен, тогда как второй белок содержит нижерасположенные сигнальные элементы и костимуляторные молекулы (такие как CD3ζ и 4-1BB). В присутствии экзогенной молекулы (такой как аналог рапамицина) связывающий и сигнальный белки димеризуются вместе, позволяя CAR-T-клеткам атаковать опухоль.
Биспецифические молекулы как переключатели: Биспецифические молекулы нацелены как на ассоциированный с опухолью антиген и молекула CD3 на поверхности Т-клеток. Это гарантирует, что Т-клетки не могут активироваться, если они не находятся в непосредственной близости от опухолевой клетки. Биспецифическая молекула против CD20 / CD3 проявляет высокую специфичность как к злокачественным В-клеткам, так и к раковым клеткам мышей. FITC - еще одна бифункциональная молекула, используемая в этой стратегии. FITC может перенаправлять и регулировать активность FITC -специфических CAR-T-клеток по отношению к опухолевым клеткам с рецепторами фолиевой кислоты.
Платформа SMDC (низкомолекулярные конъюгаты лекарственных средств) в иммуноонкологии - это экспериментальный подход, который делает возможным создание единой универсальной CAR T-клетки, которая связывается с чрезвычайно высоким сродством с доброкачественной молекулой, обозначенной как флуоресцеинизотиоцианат (FITC). Затем эти клетки используются для лечения различных типов рака при совместном введении с биспецифическими адапторными молекулами SMDC. Эти уникальные биспецифические адаптеры сконструированы из молекулы FITC и молекулы, возвращающей опухоль, для точного соединения универсальной CAR Т-клетки с раковыми клетками, что вызывает локальную активацию Т-клеток. Противоопухолевая активность у мышей индуцируется только тогда, когда присутствуют как универсальные Т-клетки CAR, так и правильные антиген-специфические адаптерные молекулы. Противоопухолевую активность и токсичность можно контролировать, регулируя дозировку вводимой адапторной молекулы. Лечение антигенно-гетерогенных опухолей может быть достигнуто путем введения смеси желаемых антиген-специфических адаптеров.
Существуют несколько проблем, с которыми сталкиваются современные методы лечения CAR Т-лимфоцитами, такие как:
