Войти
Процесс хемотаксиса можно продемонстрировать с помощью анализа с капиллярной трубкой (показано выше). Подвижные прокариоты могут ощущать химические вещества в окружающей среде и соответственно изменять свою подвижность. Когда химикатов нет, движение происходит совершенно случайно. Когда присутствует репеллент или аттрактант, подвижность изменяется; пробеги становятся длиннее, а кувырки становятся реже, так что может быть достигнуто чистое движение к химикату или от него. Чистое движение можно увидеть в стакане, где бактерии скапливаются вокруг аттрактанта и вдали от репеллента. Стакан, используемый на этой иллюстрации, взят из Wikimedia Commons - «Лабораторная посуда - Стакан » от Amanda44. Анализы хемотаксиса являются экспериментальными инструментами для оценки хемотаксической способности прокариотические или эукариотические клетки. Были разработаны самые разные методы. Некоторые методы являются качественными, что позволяет исследователю приблизительно определить хемотаксическое сродство клетки к аналиту, в то время как другие являются количественными, позволяющими точно измерить это сродство.
В общем, наиболее важным условием является калибровка времени инкубации анализа как для модельной клетки, так и для лиганд, подлежащий оценке. Слишком короткое время инкубации приводит к отсутствию клеток в образце, а слишком долгое время нарушает градиенты концентрации и измеряет более хемокинетический, чем хемотаксический ответ.
Наиболее часто используемые методы сгруппированы в две основные группы:
Анализы хемотаксиса с чашками с агаром Этот способ оценки касается агаровых пластин. агар или желатин, содержащие полутвердые слои, полученные до эксперимента. В слое вырезают небольшие лунки, которые заполняют клетками и исследуемым веществом. Клетки могут мигрировать в направлении химического градиента в полутвердом слое или под слоем. Некоторые варианты этой техники касаются также лунок и параллельных каналов, соединенных разрезом в начале эксперимента (метод PP). Радиальное расположение PP-техники (3 или более каналов) дает возможность сравнивать хемотаксическую активность различных популяций клеток или изучать предпочтения между лигандами.
Подсчет клеток: число положительных отвечающих клеток можно подсчитывать с начала миграции клетки, после окрашивания или в нативных условиях в световом микроскопе.
Камерные анализы хемотаксиса Камеры, изолированные фильтрами, являются подходящими инструментами для точного определения хемотаксического поведения. Пионерский тип этих камер был построен Бойденом. Подвижные клетки помещаются в верхнюю камеру, а жидкость, содержащая исследуемое вещество, заливается в нижнюю. Размер исследуемых подвижных клеток определяет размер пор фильтра; Важно выбрать диаметр, который позволяет осуществлять активную трансмиграцию. Для моделирования условий in vivo несколько протоколов предпочитают покрытие фильтра молекулами внеклеточного матрикса (коллаген, эластин и т. Д.). Эффективность измерений повышалась за счет разработки многолуночных камер (например, NeuroProbe), в которых параллельно оцениваются 24, 96, 384 образца. Преимущество этого варианта заключается в том, что несколько параллелей исследуются в идентичных условиях.
В другом варианте камеры соединены бок о бок по горизонтали (камера Зигмонда) или в виде концентрических колец на слайде (камера Данна). Градиент концентрации развивается на узкой соединительной перемычке между камер и количество мигрирующих клеток также подсчитывают на поверхности моста с помощью светового микроскопа. В некоторых случаях перемычка между двумя камерами заполнена агаром, и клетки должны «скользить » в этом полутвердом слое.
Некоторые капиллярные методы предусматривают также расположение камер, однако между клетками и исследуемым веществом нет фильтра. Количественные результаты достигаются с помощью многолуночного типа этого зонда с использованием 4-8-12-канальных пипеток. Точность пипетки и увеличенное количество параллельно проходящих образцов - большое преимущество этого теста.
Подсчет клеток: клетки с положительным ответом подсчитываются из нижней камеры (длительное время инкубации) или из фильтра (короткое время время инкубации). Для обнаружения клеток используются общие методы окрашивания (например, трипановый синий ) или специальные зонды (например, обнаружение mt-дегидрогеназы с помощью анализа МТТ). Также используются меченые (например, флуорохромы ) клетки, в некоторых анализах клетки метят во время трансмиграции через фильтр.
Другие методы анализа хемотаксиса Помимо вышеупомянутых двух наиболее часто используемых методов, был разработан широкий спектр протоколов для измерения хемотаксической активности. Некоторые из них носят только качественный характер, например, тесты на агрегацию, когда небольшие кусочки агара или фильтров помещаются на предметное стекло и измеряется скопление клеток вокруг.
В другом полуколичественном методе на клетки накладывают тестируемое вещество, и во время инкубации регистрируют изменения опалесценции первоначально бесклеточного отсека.
Третий часто Используемая качественная методика - лабиринт Т- и его приспособления для микропланшетов. В исходном варианте контейнер, просверленный в колышек, заполняется ячейками. Затем колышек закручивается, и клетки соприкасаются с двумя другими емкостями, заполненными другими веществами. Инкубацию останавливают, переставляя стержень, и подсчитывают количество клеток в контейнерах.
Кроме того, в последнее время все чаще и чаще используются микрофлюидные устройства для количественного и точного тестирования хемотаксиса.
