Войти
Внеклеточная ДНК плода (cffDNA ) - это плодная ДНК, которая свободно циркулирует в материнской крови. Материнская кровь взята с помощью венепункции. Анализ cffDNA - это метод неинвазивной пренатальной диагностики, который часто назначают беременным женщинам пожилого возраста материнского возраста. Через два часа после родов cffDNA больше не обнаруживается в материнской крови.
Бесклеточная ДНК плода попадает в кровоток матери. cffDNA происходит из плацентарных трофобластов. ДНК плода фрагментируется, когда микрочастицы плаценты попадают в материнскую кровь циркуляция.
фрагменты кффДНК имеют длину приблизительно 200 пар оснований (п.н.). Они значительно меньше, чем фрагменты материнской ДНК. Разница в размерах позволяет отличить cffDNA от фрагментов материнской ДНК.
Приблизительно от 11 до 13,4 процентов бесклеточной ДНК в материнской крови имеет фетальное происхождение. Сумма сильно варьируется от одной беременной женщины к другой. cffDNA присутствует через пять-семь недель беременности. Количество cffDNA увеличивается с течением беременности. Количество cffDNA в крови матери быстро уменьшается после родов. Через два часа после родов cffDNA больше не обнаруживается в материнской крови.
Анализ cffDNA может обеспечить более раннюю диагностику состояний плода, чем существующие методы. Поскольку cffDNA обнаруживается в материнской крови, отбор проб не несет сопутствующего риска самопроизвольного аборта. Анализ cffDNA имеет те же этические и практические вопросы, что и другие методы, такие как амниоцентез и отбор проб ворсинок хориона.
Некоторые недостатки отбора проб cffDNA включают низкую концентрацию cffDNA в организме матери. кровь; различия в количестве cffDNA между людьми; высокая концентрация ДНК, не содержащей материнских клеток, по сравнению с cffDNA в материнской крови.
Новые данные показывают, что процент неудачных тестов cffDNA выше, а фракция плода (соотношение ДНК плода по сравнению с материнской ДНК в образце материнской крови) ниже и PPV для трисомий 18, 13 и SCA снижается при ЭКО беременностях по сравнению с беременностями, зачатыми спонтанно.
Был разработан ряд лабораторных методов для скрининга внеклеточной ДНК плода на наличие генетические дефекты были развиты. Основными из них являются (1) массовое параллельное секвенирование (MPSS), (2) целевое массовое параллельное секвенирование (t-MPS) и (3) однонуклеотидный полиморфизм (SNP) на основе
Образец периферической крови матери берут путем венесекции примерно на 10 неделе беременности.
Плазма крови отделяется от образца материнской крови с использованием лабораторная центрифуга. Затем cffDNA выделяют и очищают. Стандартизованный протокол для этого был составлен на основе оценки научной литературы. Самый высокий выход при экстракции cffDNA был получен с «QIAamp DSP Virus Kit».
Добавление формальдегида к образцам материнской крови увеличивает выход cffDNA. Формальдегид стабилизирует неповрежденные клетки и, следовательно, препятствует дальнейшему высвобождению материнской ДНК. С добавлением формальдегида процентная доля cffDNA, извлеченной из образца материнской крови, колеблется от 0,32 до 40 процентов, в среднем 7,7 процента. Без добавления формальдегида средний процент извлеченной кффДНК составил 20,2 процента. Однако другие цифры варьируются от 5 до 96 процентов.
Извлечение cffDNA может быть связано с длиной фрагментов ДНК. Другой способ увеличения ДНК плода основан на физической длине фрагментов ДНК. Более мелкие фрагменты могут составлять до семидесяти процентов от общей внеклеточной ДНК в образце материнской крови.
В ПЦР в реальном времени флуоресцентные зонды используются для мониторинга накопления ампликонов. Репортерный флуоресцентный сигнал пропорционален количеству генерируемых ампликонов. Наиболее подходящий протокол ПЦР в реальном времени разработан в соответствии с конкретной мутацией или генотипом, которые необходимо выявить. Точечные мутации анализируют с помощью качественной ПЦР в реальном времени с использованием зондов, специфичных для аллеля . вставки и делеции анализируют путем измерения дозировки с использованием количественной ПЦР в реальном времени.
cffDNA может быть обнаружена путем обнаружения отцовских последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
определяющая пол область Y ген (SRY) и короткий тандемный повтор Y-хромосомы «DYS14» в cffDNA от 511 беременностей анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени (RT-qPCR). В 401 из 403 беременностей, когда кровь матери была взята на сроке 7 недель или более, были обнаружены оба сегмента ДНК.
Использование вложенной полимеразной цепной реакции (вложенная ПЦР) оценивали для определения пола путем обнаружения специфического сигнала Y-хромосомы в cffDNA из материнской плазмы. Вложенная ПЦР выявила 53 из 55 плодов мужского пола. CffDNA из плазмы 3 из 25 женщин с плодами женского пола содержала специфический сигнал Y-хромосомы. чувствительность вложенной ПЦР в этом эксперименте составляла 96 процентов. специфичность составила 88 процентов.
Микрожидкостные устройства позволяют количественно определять сегменты cffDNA в материнской плазме с точностью, превосходящей точность ПЦР в реальном времени. Точечные мутации, потеря гетерозиготности и анеуплоидия могут быть обнаружены за один этап ПЦР. Цифровая ПЦР позволяет различать плазму крови матери и ДНК плода в мультиплексной моде.
Высокая производительность секвенирование дробовиком с использованием таких инструментов, как Solexa или Illumina дает примерно 5 миллионов тегов последовательности на образец материнской сыворотки. Анеуплоидные беременности, такие как трисомия, были выявлены при тестировании на четырнадцатой неделе беременности. Картирование всего генома плода с помощью анализа родительского гаплотипа было выполнено с использованием секвенирования cffDNA из материнской сыворотки. Беременных самок изучали с использованием 2-сплетенного массивно-параллельного секвенирования ДНК материнской плазмы, и трисомия была диагностирована с z-значением больше 3. Секвенирование дало чувствительность 100 процентов, специфичность 97,9 процента, прогностическую ценность положительного результата 96,6 процента и отрицательная прогностическая ценность 100 процентов.
Матричная лазерная десорбция / ионизация - времяпролетная масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS) в сочетании с расширением на одно основание после ПЦР позволяет обнаруживать cffDNA со специфичностью по одному основанию и чувствительностью по одной молекуле ДНК. ДНК амплифицируют с помощью ПЦР. Затем конструируют линейную амплификацию с реакцией удлинения основания (с третьим праймером) для отжига в область, расположенную выше сайта мутации . Одно или два оснований добавляют к праймеру для удлинения для получения двух продуктов удлинения из ДНК дикого типа и мутантной ДНК. Специфичность одного основания обеспечивает преимущества по сравнению с методами на основе гибридизации с использованием зондов гидролиза TaqMan. При оценке техники не было обнаружено ни ложноположительных, ни отрицательных результатов при поиске cffDNA для определения пола плода в шестнадцати образцах плазмы матери. Пол девяноста одного плода мужского пола был правильно определен с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Этот метод имел точность, чувствительность и специфичность более 99 процентов.
Можно использовать различия в активации генов между ДНК матери и плода. Эпигенетические модификации (наследственные модификации, которые изменяют функцию гена без изменения последовательности ДНК) могут использоваться для обнаружения cffDNA. Промотор гиперметилированного RASSF1 A представляет собой универсальный фетальный маркер, используемый для подтверждения присутствия cffDNA. Описан метод, в котором cffDNA экстрагировали из материнской плазмы и затем переваривали чувствительными к метилированию и нечувствительными рестрикционными ферментами. Затем был проведен ПЦР-анализ RASSF1A, SRY и DYS14 в реальном времени. Процедура выявила 79 из 90 (88 процентов) образцов материнской крови, в которых присутствовал гиперметилированный RASSF1A.
Транскрипты мРНК генов, экспрессируемых в плаценте, обнаруживаются в материнской плазме. В этой процедуре плазма центрифугируется, поэтому появляется водный слой. Этот слой переносится и из него извлекается РНК. ОТ-ПЦР используется для обнаружения выбранной экспрессии РНК. Например, плацентарный лактоген (hPL) человека и мРНК бета-ХГЧ стабильны в материнской плазме и могут быть обнаружены. (Нг и др., 2002). Это может помочь подтвердить присутствие cffDNA в материнской плазме.
Анализ cffDNA в образце материнской плазмы позволяет пренатальное определение пола. Применения пренатального определения пола включают:
По сравнению с акушерское ультразвуковое исследование, которое ненадежно для определения пола в первом триместре и амниоцентез, который несет небольшой риск выкидыша, забор материнской плазмы для анализа cffDNA без риска. Основными мишенями в анализе cffDNA являются ген, ответственный за белок Y области, определяющей пол (SRY) на Y-хромосоме и последовательность DYS14.
При врожденной гиперплазии надпочечников в коре надпочечников отсутствует соответствующий синтез кортикостероидов, что приводит к избытку андрогенов надпочечников и поражает плоды женского пола. Происходит внешняя маскулинизация половых органов у плодов женского пола. Матери из группы риска получают дексаметазон на 6 неделе беременности для подавления высвобождения гипофизом андрогенов.
, если анализ cffDNA, полученный из образца материнской плазмы, не имеет генетических маркеры, обнаруженные только на Y-хромосоме, наводят на мысль о плоде женского пола. Однако это также может указывать на сбой самого анализа (ложноотрицательный результат). Отцовские генетические полиморфизмы и независимые от пола маркеры могут использоваться для обнаружения cffDNA. Для этого приложения должна присутствовать высокая степень гетерозиготности этих маркеров.
Пренатальное ДНК-тестирование на отцовство коммерчески доступно. Тест можно проводить на девятой неделе беременности.
Аутосомно-доминантные и рецессивные Заболевания с одним геном, которые были диагностированы пренатально путем анализа наследуемой от отца ДНК, включают кистозный фиброз, бета-талассемия, серповидно-клеточная анемия, спинальная мышечная атрофия и миотоническая дистрофия. Пренатальная диагностика заболеваний одного гена, вызванных аутосомно-рецессивной мутацией, наследуемой по материнской линии аутосомно-доминантной мутацией или мутациями больших последовательностей, которые включают дупликацию, экспансию или вставку последовательностей ДНК, является более сложной задачей.
В cffDNA фрагменты Длину 200–300 п.н., связанную с нарушением единичного гена, обнаружить труднее.
Например, аутосомно-доминантное заболевание ахондроплазия вызвано точечной мутацией гена FGFR3. В двух беременностях с плодом с ахондроплазией была обнаружена отцовская мутация G1138A из cffDNA из образца материнской плазмы в одной и мутация G1138A de novo в другом.
В исследованиях генетики Хантингтона. chorea с использованием qRT-PCR cffDNA из образцов материнской плазмы, CAG-повторы были обнаружены на нормальном уровне (17, 20 и 24).
cffDNA также может использоваться для диагностики расстройства одного гена. Развитие лабораторных процессов с использованием cffDNA может позволить пренатальную диагностику анеуплоидий, таких как трисомия 21 (синдром Дауна) у плода.
Несовместимость плодных и материнских антигенов RhD является основной причиной гемолитической болезни новорожденных. Примерно 15 процентов белых женщин, 3-5 процентов чернокожих африканских женщин и менее 3 процентов азиатских женщин являются RhD-отрицательными.
Точная пренатальная диагностика важна, потому что заболевание может быть фатальным для новорожденного и потому что матерям из группы риска можно назначать лечение, включающее внутримышечный иммуноглобулин (анти-D) или внутривенный иммуноглобулин. 100>
ПЦР для обнаружения RHD (ген) гена экзонов 5 и 7 из cffDNA, полученной из материнской плазмы между 9 и 13 неделями беременности, дает высокую степень специфичности, чувствительности и диагностическая точность (>90 процентов) по сравнению с определением RhD из сыворотки пуповинной крови новорожденного. Аналогичные результаты были получены в отношении экзонов 7 и 10. Цифровая капельная ПЦР для определения RhD у плода была сопоставима с обычным методом ПЦР в реальном времени.
Обычное определение RhD-статуса плода на основе cffDNA в материнской сыворотке позволяет на раннем этапе управлять риск беременностей при одновременном снижении ненужного использования Anti-D более чем на 25 процентов.
Анализ вкДНК материнской сыворотки с помощью высокопроизводительного секвенирования может выявить общие половые хромосомы плода анеуплоидии, например, синдром Тернера, синдром Клайнфельтера и синдром тройной X, но прогностическая ценность положительного результата процедуры низкая.
Трисомия плода по хромосоме 21 является причиной синдрома Дауна. Эта трисомия может быть обнаружена путем анализа cffDNA из материнской крови с помощью массового параллельного секвенирования дробовика (MPSS). Другой метод - цифровой анализ выбранных регионов (DANSR). Такие тесты показывают чувствительность около 99% и специфичность более 99,9%. Следовательно, они не могут рассматриваться как диагностические процедуры, но могут использоваться для подтверждения положительного результата скринингового теста матери, такого как скрининг первого триместра или ультразвуковые маркеры состояния.
Анализ cffDNA из материнской плазмы с помощью Возможно MPSS для поиска трисомии 13 или 18
Факторы, ограничивающие чувствительность и специфичность, включают уровни cffDNA в материнской плазме; материнские хромосомы могут иметь мозаицизм.
Может быть обнаружен ряд молекул нуклеиновых кислот плода, происходящих из анеуплоидных хромосом, включая мРНК SERPINEB2, оболочку B, гипометилированный SERPINB5 с хромосомы 18, плацентоспецифическую 4 (PLAC4), гиперметилированную голетокарбоксилазу (синтетическая голетокарбоксилаза) HLCS) и мРНК c21orf105 с хромосомы 12. При полной трисомии аллели мРНК в материнской плазме не соответствуют нормальному соотношению 1: 1, а фактически составляют 2: 1. Соотношения аллелей, определяемые эпигенетическими маркерами, также можно использовать для обнаружения полных трисомий. Массивное параллельное секвенирование и цифровая ПЦР для обнаружения анеуплоидии плода могут использоваться без ограничения специфическими для плода молекулами нуклеиновых кислот. (MPSS) имеет чувствительность от 96 до 100% и специфичность от 94 до 100% для выявления синдрома Дауна. Его можно проводить на 10 неделе гестационного возраста. Одно исследование, проведенное в Соединенных Штатах, оценило ложноположительный уровень в 0,3% и положительную прогностическую ценность в 80% при использовании cffDNA для выявления синдрома Дауна.
Преэклампсия - сложное состояние беременности, включающее гипертензию и протеинурию обычно после 20 недель беременности. Это связано с плохой цитотрофобластической инвазией миометрия. Начало заболевания на сроке от 20 до 34 недель беременности считается «ранним». Образцы материнской плазмы при беременности, осложненной преэклампсией, имеют значительно более высокие уровни вкДНК, чем при нормальной беременности. Это верно для преэклампсии с ранним началом.
Секвенирование нового поколения может быть использовано для получения полногеномной последовательности из cffDNA. Это поднимает этические вопросы. Однако полезность процедуры может возрасти по мере обнаружения четкой связи между конкретными генетическими вариантами и болезненными состояниями.
