Войти
| Карбоксипептидаза A | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Карбоксипептидаза A из поджелудочной железы крупного рогатого скота | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Номер EC | 3.4.17.1 | ||||||||
| Номер CAS | 9031-98-5 | ||||||||
| Базы данных | |||||||||
| IntEnz | Представление IntEnz | ||||||||
| BRENDA | Запись BRENDA | ||||||||
| ExPASy | Представление NiceZyme | ||||||||
| KEGG | Запись KEGG | ||||||||
| MetaCyc | метаболический путь | ||||||||
| PRIAM | профиль | ||||||||
| PDB структуры | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
| Ген Онтология | AmiGO / QuickGO | ||||||||
| |||||||||
Карбоксипептидаза A обычно относится к панкреатической экзопептидазе, которая гидролизует пептидные связи С-концевых остатков с ароматическими или алифатические боковые цепи. Большинство ученых в этой области теперь называют этот фермент CPA1, а родственную панкреатическую карбоксипептидазу - CPA2.
Кроме того, есть еще 4 млекопитающих ферменты, названные от CPA-3 до CPA-6, и ни один из них не экспрессируется в поджелудочной железе. Вместо этого эти другие ферменты, подобные CPA, выполняют разнообразные функции.
CPA-1 и CPA-2 (и, как предполагается, все другие CPA) используют ион цинка в белке для гидролиза. пептидной связи на С-конце аминокислотного остатка. Потеря цинка приводит к потере активности, которую можно легко заменить цинком, а также некоторыми другими двухвалентными металлами (кобальтом, никелем ). Карбоксипептидаза А продуцируется в поджелудочной железе и имеет решающее значение для многих процессов в организме человека, включая пищеварение, посттрансляционную модификацию белков, свертывание крови и размножение.
Такой обширный набор функций для одного белка делает его идеальной моделью для исследований других цинковых протеаз неизвестной структуры. Недавние биомедицинские исследования коллагеназы, энкефлиназы и ангиотензинпревращающего фермента использовали карбоксипептидазу А для синтеза ингибитора и кинетических испытаний. Например, препарат для лечения высокого кровяного давления, Каптоприл, был разработан на основе ингибитора карбоксипептидазы А. Карбоксипептидаза А и целевой фермент каптоприла, ангиотензинпревращающего фермента, имеют очень похожие структуры, поскольку оба они содержат ион цинка в активном центре. Это позволило использовать мощный ингибитор карбоксипептидазы A для ингибирования фермента и, таким образом, снижения артериального давления через систему ренин-ангиотензин-альдостерон.
Карбоксипептидаза A (CPA) содержит металлический центр цинка (Zn) в тетраэдрической геометрии с аминокислотными остатками в непосредственной близости от цинка для облегчения катализа и связывания. Из 307 аминокислот, связанных в пептидной цепи, следующие аминокислотные остатки важны для катализа и связывания; Glu-270, Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145 и Tyr-248. На рисунке 1 показан активный центр тетраэдрического комплекса цинка с важными аминокислотными остатками, которые окружают комплекс.
Металлический цинк представляет собой сильный электрофильный катализатор на основе кислоты Льюиса, который стабилизирует координированную молекулу воды, а также стабилизирует отрицательные промежуточные соединения, которые происходят на протяжении гидролитической реакции. Стабилизации как скоординированной молекулы воды, так и отрицательных промежуточных продуктов способствуют полярные остатки в активном центре, которые находятся в непосредственной близости для облегчения образования водородных связей.
Рисунок 1. Активный сайт CPA Активный сайт можно разделить на два субстрата -сайты обозначены как S 1 'и S 1. Субсайт S 1 ’представляет собой гидрофобный карман фермента, а Tyr-248 действует,« закрывая »гидрофобный карман после связывания субстрата или ингибитора (SITE). Водородная связь от гидроксильной группы в Tyr-248 облегчает эту конформацию из-за взаимодействия с концевыми карбоксилатами связывающихся субстратов. Для этого фермента требуется существенное движение, и модель индуцированной подгонки объясняет, как происходит это взаимодействие.
Триада остатков взаимодействуют с C-концевым карбоксилатом посредством водородной связи:
Карбоксипептидаза A, классифицированная как металлоэкзопептидаза, состоит из одной полипептидной цепи, связанной с ионом цинка. Этот характерный ион металла расположен в активном центре фермента вместе с пятью аминокислотными остатками, которые участвуют в связывании субстрата: Arg-71, Arg-127, Asn-144, Arg-145, Tyr-248 и Glu- 270. Рентгеноструктурные исследования выявили пять участков белка. Эти аллостерические сайты участвуют в создании специфичности лиганд-фермент, наблюдаемой у большинства биоактивных ферментов. Один из этих субсайтов вызывает конформационное изменение Tyr-248 при связывании молекулы субстрата на первичном активном сайте. Фенольный гидроксил тирозина образует водородную связь с концевым карбоксилатом лиганда. Кроме того, между тирозином и пептидной связью более длинных пептидных субстратов образуется вторая водородная связь. Эти изменения значительно усиливают связь между ферментом и лигандом, будь то субстрат или ингибитор. Это свойство карбоксипептидазы А привело к первому пункту гипотезы «индуцированного соответствия» Дэниела Э. Кошланда-младшего.
Субсайт S 1 - это место, где происходит катализ в CPA, и ион цинка координируется остатками ферментов Glu-72, His-69 и His-196. Существует плоскость, которая пересекает бороздку активного центра, где остатки Glu-270 и Arg-127 находятся на противоположных сторонах комплекса, связанного с цинком и водой. Цинк богат электронами из-за глутаминовых лигандов, координирующих цинк, потому что перед связыванием субстрата Glu-72 координирует бидентатно, но переходит в монодентатный после связывания субстрата. В результате металлический цинк не способен депротонировать скоординированную молекулу воды с образованием гидроксильного нуклеофила.
Рисунок 2. Катализируемый CPA протеолиз, стимулируемый координированной молекулой воды. Glu-270 и Arg- 127 играют важную роль в катализе, показанном на рисунке 2. Arg-127 действует, стабилизируя карбонил субстрата, который связан с аминогруппой фенилаланина. Одновременно координированная с цинком молекула воды депротонируется Glu-270 и взаимодействует с карбонилом, стабилизированным Arg-127. Это создает промежуточное соединение, показанное на Рисунке 2, где отрицательно заряженный кислород координируется с цинком, и за счет неблагоприятных электростатических взаимодействий между Glu-270 и ионизированным продуктом способствует высвобождению продукта в конце катализа.
В недавних компьютерных исследованиях механизм катализа аналогичен, но различие в механизме состоит в том, что молекула депротонированной воды связывается с углеродом карбонила, тогда как на рисунке 2 показано, что гидроксильная группа остается скоординированной с цинком. Затем происходит протеолиз, и молекула воды затем вводится обратно в активный центр для координации с цинком.
Было проведено несколько исследований, изучающих детали связи между карбоксипептидазой А и субстратом и то, как это влияет на скорость гидролиза.. В 1934 году в ходе кинетических экспериментов было впервые обнаружено, что для связывания субстрата гидролизуемый пептид должен находиться рядом с концевой свободной гидроксильной группой. Также скорость гидролиза может быть увеличена, если С-концевой остаток является разветвленным алифатическим или ароматическим. Однако, если субстрат представляет собой дипептид со свободной аминогруппой, он медленно подвергается гидролизу; этого, однако, можно избежать, если аминогруппа блокируется N-ацилированием
Совершенно очевидно, что структура фермента, а именно активный центр, очень важна для понимания механизма реакции.. По этой причине Рис и его коллеги изучили комплекс фермент-лиганд, чтобы получить четкий ответ на вопрос о роли иона цинка. Эти исследования показали, что в свободном ферменте координационное число цинка равно пяти; металлический центр координирован с двумя атомами азота имидазола Nδ1, двумя карбоксилатными атомами кислорода глутамата-72 и молекулой воды с образованием искаженного тетраэдра. Однако, как только лиганд связывается в активном сайте карбоксипептидазы A, это координационное число может варьироваться от пяти до шести. При связывании с дипептидом глицил-L-тирозином аминный азот дипептида и карбонильный кислород замещают водный лиганд. Это дало бы координационное число шесть для цинка в комплексе карбоксипептидаза А-дипептид-глицил-L-тирозин. Карты электронной плотности показали, что аминный азот занимает вторую позицию рядом с глутаматом-270. Близость этих двух остатков приведет к стерическому затруднению, препятствующему координации водного лиганда с цинком. Это приведет к координационному числу пять. Данные для обоих значительны, что указывает на то, что обе ситуации возникают естественным образом
Существует два предложенных механизма каталитической функции карбоксипептидазы А. Первый представляет собой нуклеофильный путь с участием ковалентного промежуточного ацильного фермента, содержащего основание активного центра Glu-270.. Свидетельства для этого промежуточного ангидрида неоднозначны; Сух и его коллеги выделили то, что предполагается ацильным промежуточным соединением. Однако подтверждение наличия ацильного фермента было выполнено без экспериментов по улавливанию, что делает выводы слабыми.
Второй предложенный механизм - это активированный водный путь. Этот механизм включает атаку молекулы воды на ножничную пептидную связь субстрата. Этому процессу способствует ион цинка и помогает остаток Glu-270.
