Войти
Хайдер, Эйвери, МакЛауд и Маккарти использовали нити очищенной ДНК, такие как эта, осажденные из растворов клеточных компонентов для выполнения бактериальных трансформаций Эксперимент Эйвери-Маклауда-Маккарти был экспериментальной демонстрацией, о которой в 1944 году сообщил Освальд Эйвери, Колин МакЛауд и Маклин Маккарти, что ДНК является веществом, вызывающим бактериальную трансформацию, в то время, когда широко считалось, что это было белки, которые выполняли функцию переноса генетической информации (само слово «белок» придумано для обозначения убеждения, что его функция была первичной). Это было кульминацией исследований в Рокфеллеровском институте медицинских исследований в 1930-х и начале 20-го века, целью которых было очистить и охарактеризовать «принцип трансформации», ответственный за феномен трансформации, впервые описанный в эксперименте Гриффитса 1928 г.: убит Streptococcus pneumoniae из вирулентного штамма типа III-S при инъекции вместе с живыми, но невирулентными пневмококками типа II-R, что привело к смертельной инфекции типа III-S пневмококки. В своей статье «Исследования химической природы вещества, вызывающего трансформацию пневмококков: индукция трансформации фракцией дезоксирибонуклеиновой кислоты, выделенной из пневмококка типа III», опубликованной в февральском выпуске журнала Journal of Experimental Medicine <113 за 1944 год.>, Эйвери и его коллеги предполагают, что ДНК, а не белок, как широко распространено в то время, может быть наследственным материалом бактерий и может быть аналогом генов и / или вирусов в высших организмах.
Эйвери и его коллеги показали, что ДНК была ключевым компонентом эксперимента Гриффита, в котором мышам вводят мертвые бактерии одного штамма и живые бактерии другого, и у них развивается инфекция тип мертвого штамма. С развитием серологического типирования медицинские исследователи смогли разделить бактерии на различные штаммы или типы. Когда человеку или подопытному животному (например, мышь ) прививают конкретный тип, возникает иммунный ответ, генерирующий антитела которые специфически реагируют с антигенами на бактерии. Сыворотка крови, содержащая антитела, затем может быть извлечена и применена к культивированным бактериям. Антитела будут реагировать с другими бактериями того же типа, что и исходная инокуляция. Фред Нойфельд, немецкий бактериолог, открыл пневмококковые типы и серологическое типирование; до исследований Фредерика Гриффита бактериологи считали, что типы являются фиксированными и неизменными от одного поколения к другому.
Эксперимент Гриффита, опубликованный в 1928 году, выявил некий «трансформирующий принцип» в пневмококковой инфекции. бактерии могут преобразовывать их из одного типа в другой. Гриффит, британский медицинский работник, провел годы, применяя серологическое типирование к случаям пневмонии, часто смертельной болезни в начале 20 века. Он обнаружил, что несколько типов - некоторые вирулентные, а некоторые невирулентные - часто присутствовали в течение клинического случая пневмонии, и полагал, что один тип может превратиться в другой (а не просто несколько типов, присутствующих все время). Проверяя эту возможность, он обнаружил, что трансформация может происходить, когда мертвые бактерии вирулентного типа и живые бактерии невирулентного типа вводятся мышам: у мышей разовьется смертельная инфекция (обычно вызываемая только живыми бактериями вирулентного типа). type) и погибнуть, и вирулентные бактерии могли быть выделены от таких инфицированных мышей.
Результаты эксперимента Гриффита вскоре были подтверждены, сначала Фредом Нойфельдом из Института Коха и Мартином Генри Доусоном из Института Рокфеллера. В последующие годы ряд исследователей из Института Рокфеллера продолжали изучать трансформацию. С, Доусон разработал метод трансформации бактерий in vitro (а не in vivo, как это сделал Гриффит). После отъезда Доусона в 1930 году он предпринял попытку расширить открытия Гриффита, что привело к экстракции водных растворов принципа трансформации к 1933 году. Колин МакЛауд работал над очисткой таких растворов с 1934 по 1937 год, и эта работа был продолжен в 1940 году и завершен Маклином Маккарти.
Пневмококк характеризуется гладкими колониями, которые имеют полисахаридную капсулу, которая индуцирует образование антитела ; различные типы классифицируются в соответствии с их иммунологической специфичностью.
Процедура очистки, которую предпринял Эйвери, состояла из сначала уничтожения бактерий нагреванием и экстракции компонентов, растворимых в физиологическом растворе. Затем белок осаждали, используя хлороформ, и капсулы полисахарида гидролизовали с помощью фермента. Иммунологическая преципитация, вызванная типоспецифическими антителами, была использована для проверки полного разрушения капсул. Затем активную часть осаждали спиртовым фракционированием, в результате чего получали волокнистые нити, которые можно было удалить с помощью палочки для перемешивания.
Химический анализ показал, что пропорции углерода, водорода, азота, и фосфор в этой активной части соответствовали химическому составу ДНК. Чтобы показать, что за трансформацию отвечает ДНК, а не небольшое количество РНК, белка или какой-либо другой компонент клетки, Эйвери и его коллеги использовали ряд биохимических тестов. Они обнаружили, что трипсин, химотрипсин и рибонуклеаза (ферменты, расщепляющие белки или РНК) не влияли на него, но ферментный препарат «дезоксирибонуклеодеполимеразы» (a сырой препарат, полученный из ряда животных источников, который мог расщеплять ДНК) разрушил трансформирующую силу экстракта.
Последующая работа в ответ на критику и вызовы включала очистку и кристаллизацию, выполненную Моисеем Куниц в 1948 году о ДНК-деполимеразе (дезоксирибонуклеаза I ) и точная работа Роллина Хотчкисса, показывающая, что практически весь обнаруженный азот в очищенной ДНК происходил из глицин, продукт распада нуклеотидного основания аденин, и это необнаруженное белковое загрязнение, по оценке Хотчкисса, составляло не более 0,02%.
Освальд Эйвери 
Колин МакЛауд 
Маклин Маккарти (с Уотсоном и Криком )Экспериментальные результаты эксперимента Эйвери-МакЛауда-Маккарти были быстро подтверждены и распространены на другие наследственные характеристики помимо полисахаридных капсул. Однако было значительное нежелание принять вывод о том, что ДНК является генетическим материалом. Согласно влиятельному "" Фебуса Левена, ДНК состоит из повторяющихся единиц четырех нуклеотидных оснований и имеет небольшую биологическую специфичность. Поэтому считалось, что ДНК является структурным компонентом хромосом, в то время как гены, вероятно, состоят из белкового компонента хромосом. Эта линия мышления была подкреплена кристаллизацией вируса табачной мозаики в 1935 году Венделлом Стэнли, а также параллелями между вирусами, генами и ферментами; многие биологи думали, что гены могут быть своего рода «суперферментом», а вирусы, согласно Стэнли, были белками и обладают свойством автокатализа со многими ферментами. Кроме того, немногие биологи думали, что генетика может быть применена к бактериям, поскольку у них отсутствовали хромосомы и половое размножение. В частности, многие генетики, неофициально известные как группа фагов, которые станут влиятельными в новой дисциплине молекулярной биологии в 1950-х годах, пренебрегали ДНК как генетическим материалом ( и были склонны избегать «грязных» биохимических подходов Эйвери и его коллег). Некоторые биологи, в том числе научный сотрудник Института Рокфеллера Альфред Мирски, оспаривали открытие Эйвери о том, что принцип трансформации - это чистая ДНК, предполагая, что вместо этого виноваты белковые примеси. Хотя трансформация произошла в некоторых видах бактерий, она не могла быть воспроизведена в других бактериях (или в каких-либо высших организмах), и ее значение, казалось, ограничивалось прежде всего медициной.
Ученые, оглядываясь назад на Эйвери-Маклауд-Маккарти Эксперимент расходятся во мнениях относительно его влияния в 1940-х и начале 1950-х годов. Гюнтер Стент предположил, что это в значительной степени игнорировалось и прославлялось только впоследствии - аналогично работе Грегора Менделя за десятилетия до появления генетики. Другие, такие как Джошуа Ледерберг и Лесли К. Данн, свидетельствуют о его раннем значении и называют этот эксперимент началом молекулярной генетики.
Несколько микробиологов и генетиков интересовались физической и химической природой генов до 1944 года, но эксперимент Эйвери-МакЛауда-Маккарти вызвал новый и более широкий интерес к этому предмету. Хотя в оригинальной публикации генетика конкретно не упоминалась, Эйвери, а также многие генетики, читавшие статью, знали о генетических последствиях - что Эйвери, возможно, выделил сам ген как чистую ДНК. Биохимик Эрвин Чаргафф, генетик Х. Дж. Мюллер и другие похвалили результат как установление биологической специфичности ДНК и как имеющий важное значение для генетики, если ДНК играла аналогичную роль в высших организмах. В 1945 году Королевское общество наградило Эйвери медалью Копли, частично за его работу по бактериальной трансформации.
Между 1944 и 1954 годами на эту статью по крайней мере ссылались. 239 раз (с равномерным распределением цитирования по тем годам), в основном в статьях по микробиологии, иммунохимии и биохимии. В дополнение к последующей работе Маккарти и других сотрудников Института Рокфеллера в ответ на критику Мирского, эксперимент стимулировал значительную работу в области микробиологии, где он пролил новый свет на аналогии между наследственностью бактерий и генетикой организмов, размножающихся половым путем. Французский микробиолог заявил, что расширил результаты бактериальной трансформации Эвери на Escherichia coli, хотя другие исследователи это не подтвердили. Однако в 1946 году Джошуа Ледерберг и Эдвард Татум продемонстрировали бактериальную конъюгацию в E. coli и показали, что генетика может применяться к бактериям, даже если специфический метод трансформации Эйвери не был общим. Работа Эйвери также побудила Мориса Уилкинса продолжить рентгеновские кристаллографические исследования ДНК, несмотря на то, что он столкнулся с давлением со стороны спонсоров, чтобы сосредоточить свои исследования на целых клетках, а не на биомолекулах.
Несмотря на значительное количество цитирований статьи и положительных отзывов, полученных в последующие годы после публикации, работа Эйвери в значительной степени игнорировалась научным сообществом. Хотя многие ученые положительно восприняли этот эксперимент, он не оказал серьезного воздействия на основные генетические исследования, отчасти потому, что он не имел большого значения для классических генетических экспериментов, в которых гены определялись их поведением в экспериментах по разведению, а не их химическим составом. Х. Дж. Мюллер, хотя и был заинтересован, сосредоточился больше на физических, а не на химических исследованиях гена, как и большинство членов фаговой группы . Нобелевский фонд также пренебрегал работой Эйвери, который позже выразил публичное сожаление по поводу того, что не присуждал Эйвери Нобелевскую премию.
ко времени проведения эксперимента Херши-Чейза 1952 года генетики были более склонны рассматривать ДНК как генетический материал, а Альфред Херши был влиятельным членом группы фагов. Эрвин Чаргафф показал, что базовый состав ДНК варьируется в зависимости от вида (вопреки гипотезе о тетрануклеотидах), а в 1952 году Роллин Гочкис опубликовал свои экспериментальные данные, подтверждающие работу Чаргаффа и демонстрирующие отсутствие белка в трансформирующем принципе Эйвери. Более того, область бактериальной генетики быстро становилась общепринятой, и биологи были более склонны рассматривать наследственность в тех же терминах, что и бактерии, и высшие организмы. После того, как Херши и Чейз использовали радиоактивные изотопы, чтобы показать, что именно ДНК, а не белок, попадает в бактерии при заражении бактериофагом, вскоре было широко признано, что ДНК была материалом. Несмотря на гораздо менее точные экспериментальные результаты (они обнаружили немалое количество белка, поступающего в клетки, а также ДНК), эксперимент Херши-Чейза не подвергался такой же степени сложности. Его влияние было усилено растущей сетью группы фагов и, в следующем году, известностью вокруг структуры ДНК, предложенной Уотсоном и Криком (Уотсон был также членом фаговая группа). Однако только ретроспективно оба эксперимента окончательно доказали, что ДНК является генетическим материалом.
.
