Войти
Структура РНК-аптамера, специфичного для биотина. Поверхность и скелет аптамера показаны желтым цветом. Биотин (сферы) плотно прилегает к полости на поверхности РНК Аптамеры (от латинского aptus - фит и греческого meros - часть) - это олигонуклеотид или пептид молекулы, которые связываются с определенной молекулой-мишенью. Аптамеры обычно создаются путем выбора их из большого пула случайных последовательностей , но природные аптамеры также существуют в рибопереключателях. Аптамеры могут использоваться как для фундаментальных исследований, так и в клинических целях в качестве макромолекулярных препаратов. Аптамеры можно комбинировать с рибозимами для саморасщепления в присутствии их молекулы-мишени. У этих составных молекул есть дополнительные исследования, промышленные и клинические применения.
Более конкретно, аптамеры можно классифицировать как аптамеры
Аптамеры нуклеиновых кислот - это виды нуклеиновых кислот (next-gen имитаторы антител), обладающие селективностью на уровне антител для данной мишени, созданной in vitro отбор или, что эквивалентно, SELEX (систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения ) в диапазоне от небольших объектов, таких как ионы тяжелых металлов в крупные объекты, такие как клетки. На молекулярном уровне аптамеры связываются со своей родственной мишенью посредством различных нековалентных взаимодействий, а именно электростатических взаимодействий, гидрофобных взаимодействий и индуцированной подгонки. Аптамеры полезны в биотехнологических и терапевтических применениях, поскольку они предлагают свойства молекулярного распознавания, которые конкурируют со свойствами обычно используемых биомолекул, антител. Помимо четкого распознавания, аптамеры обладают преимуществами перед антителами, поскольку они могут быть полностью сконструированы в пробирке, легко производятся путем химического синтеза, обладают желаемыми свойствами хранения и не вызывают иммуногенности или не вызывают ее в терапевтических целях..
В 1990 году две лаборатории независимо друг от друга разработали методику отбора: Gold lab, используя термин SELEX для своего процесса отбора РНК лигандов против Т4 ДНК-полимеразы ; и лаборатория Szostak, придумавшая термин «селекция in vitro», выбрав лиганды РНК против различных органических красителей. Лаборатория Шостака также ввела термин аптамер (от латинского apto, что означает «соответствовать») для этих лигандов на основе нуклеиновых кислот. Два года спустя лаборатория Szostak и Gilead Sciences, независимо друг от друга, использовали схемы отбора in vitro для создания одноцепочечных ДНК-лигандов для органических красителей и человеческого коагулянта, тромбина (см. антитромбиновые аптамеры ) соответственно. По-видимому, не существует каких-либо систематических различий между аптамерами РНК и ДНК, за исключением большей внутренней химической стабильности ДНК.
Идею селекции in vitro предшествовало двадцать с лишним лет назад, когда Сол Шпигельман использовал репликационную систему Qbeta как способ развития самореплицирующейся молекулы. Кроме того, за год до публикации результатов селекции in vitro и SELEX Джеральд Джойс использовал систему, которую он назвал «направленной эволюцией», для изменения активности расщепления рибозима.
С момента открытия аптамеров многие исследователи использовали отбор аптамеров как средство для применения и открытия. В 2001 г. процесс отбора in vitro был автоматизирован Дж. Колином Коксом в лаборатории Эллингтона в Техасском университете в Остине, что позволило сократить продолжительность эксперимента по селекции с шести недель до трех дней.
Хотя процесс искусственной разработки лигандов нуклеиновых кислот очень интересен для биологии и биотехнологии, понятие аптамеров в мире природы еще не было раскрыто до 2002 года, когда две группы во главе с Рональдом Брейкером и Евгений Нудлер открыли генетический регуляторный элемент на основе нуклеиновых кислот (который получил название рибопереключатель ), который обладает свойствами молекулярного распознавания, аналогичными свойствам искусственно созданных аптамеров. В дополнение к открытию нового способа генетической регуляции, это добавляет дополнительную достоверность понятию «Мира РНК », постулируемого этапа во времени в происхождении жизни на Земле.
И ДНК, и РНК-аптамеры демонстрируют высокую аффинность связывания с различными мишенями. Аптамеры ДНК и РНК были выбраны для одной и той же мишени. Эти мишени включают лизоцим, тромбин, транс-действующий чувствительный элемент вируса иммунодефицита человека (HIV TAR), гемин, интерферон γ, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), простатоспецифический антиген (PSA), дофамин и неклассический онкоген, фактор теплового шока 1 (HSF1). В случае лизоцима, ВИЧ TAR, VEGF и дофамина аптамер ДНК является аналогом аптамера РНК, с тимином, заменяющим урацил. Аптамеры гемина, тромбина и интерферона γ, ДНК и РНК были отобраны путем независимого отбора и имеют уникальные последовательности. Учитывая, что не все ДНК-аналоги аптамеров РНК проявляют функциональность, корреляция между последовательностью ДНК и РНК, их структурой и функцией требует дальнейшего изучения.
В последнее время была введена концепция интеллектуальных аптамеров и интеллектуальных лигандов в целом. Он описывает аптамеры, выбранные с помощью предварительно определенного равновесия (
Последние разработки в области терапии на основе аптамеров были вознаграждены в виде первого препарата на основе аптамера, одобренного Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) для лечения детей возраста. связанная с дегенерацией желтого пятна (AMD), называемая Macugen, предлагаемая OSI Pharmaceuticals. Кроме того, компания NeoVentures Biotechnology Inc. успешно коммерциализировала первую диагностическую платформу на основе аптамеров для анализа микотоксинов в зерне. Многие контрактные компании разрабатывают аптамеры и аптамеры для замены антител в исследованиях, диагностических платформах, разработке лекарств и терапевтических средствах.
Немодифицированные аптамеры быстро выводятся из кровотока, с периодом полураспада от нескольких минут до часов, в основном из-за деградации нуклеазы и выведения из организма почками в результате низкий молекулярный вес аптамера. Применение немодифицированных аптамеров в настоящее время сосредоточено на лечении переходных состояний, таких как свертывание крови, или лечении таких органов, как глаз, где возможна местная доставка. Такое быстрое очищение может быть преимуществом в таких приложениях, как диагностическая визуализация in vivo. Примером является тенасцин-связывающий аптамер, разрабатываемый Schering AG для визуализации рака. Несколько модификаций, таких как 2'-фторзамещенные пиримидины, связь полиэтиленгликоля (PEG) и т.д. (обе из которых используются в Macugen, аптамере, одобренном FDA). доступный для ученых, с помощью которого можно легко увеличить период периода полужизни аптамеров в сыворотке крови до дневной или даже недельной шкалы.
Другой подход к повышению устойчивости аптамеров к нуклеазам заключается в разработке шпигельмеров, которые полностью состоят из остова неестественной L-рибонуклеиновой кислоты. Шпигельмер с той же последовательностью имеет те же связывающие свойства, что и соответствующий аптамер РНК, за исключением того, что он связывается с зеркальным отображением своей молекулы-мишени.
Помимо разработки терапевтических средств на основе аптамеров, многие исследователи, такие как лаборатория Эллингтона, разрабатывают диагностические методы для определения профиля белков плазмы на основе аптамеров, называемых. Эта технология позволит в будущем проводить измерения белков с множеством биомаркеров, которые могут помочь в диагностике различий между заболеваниями и здоровыми состояниями.
Кроме того, лаборатория Хирао применила расширение генетического алфавита с использованием неестественной пары оснований к SELEX и достигла создания высокоаффинных ДНК-аптамеров. Только небольшое количество гидрофобных неестественных оснований в качестве пятого основания значительно увеличивает сродство аптамера к целевым белкам.
В качестве ресурса для всех экспериментов по селекции in vitro и SELEX лаборатория Эллингтона разработала каталогизацию всех опубликованных экспериментов.
Пептидные аптамеры - это искусственные белки, выбранные или сконструированные для связывания определенных молекул-мишеней. Эти белки состоят из одной или нескольких пептидных петель с вариабельной последовательностью, отображаемых белковым каркасом. Обычно они выделяются из комбинаторных библиотек и часто впоследствии улучшаются путем направленной мутации или раундов мутагенеза вариабельной области и отбора. In vivo пептидные аптамеры могут связывать клеточные белки-мишени и оказывать биологические эффекты, включая вмешательство в нормальные белковые взаимодействия их молекул-мишеней с другими белками. Библиотеки пептидных аптамеров использовались в качестве «мутагенов » в исследованиях, в которых исследователь вводит библиотеку, которая экспрессирует различные пептидные аптамеры в популяцию клеток, отбирает желаемый фенотип и определяет те аптамеры, которые вызывают фенотип. Затем исследователь использует эти аптамеры в качестве приманки, например, в дрожжевых двугибридных скринингах для идентификации клеточных белков, на которые нацелены эти аптамеры. Такие эксперименты идентифицируют определенные белки, связанные аптамерами, и взаимодействия белков, которые аптамеры нарушают, вызывая фенотип. Кроме того, пептидные аптамеры, дериватизированные с соответствующими функциональными группами, могут вызывать специфические посттрансляционные модификации своих белков-мишеней или изменять субклеточную локализацию мишеней.
Пептидные аптамеры также могут распознавать мишени in vitro. Они нашли применение вместо антител в биосенсорах и используются для обнаружения активных изоформ белков из популяций, содержащих как неактивные, так и активные формы белка. Производные, известные как головастики, в которых «головы» пептидных аптамеров ковалентно связаны с «хвостами» двухцепочечной ДНК с уникальной последовательностью, позволяют количественно определять дефицитные целевые молекулы в смесях с помощью ПЦР (с использованием, например, количественного в реальном времени полимеразная цепная реакция ) их ДНК-хвостов.
Пептиды, которые образуют вариабельные области аптамера, синтезируются как часть той же полипептидной цепи, что и каркас, и ограничиваются на своих N- и C-концах за счет связывания с Это. Это двойное структурное ограничение уменьшает разнообразие конформаций, которые могут принимать вариабельные области, и это уменьшение конформационного разнообразия снижает энтропийную стоимость молекулярного связывания, когда взаимодействие с мишенью заставляет вариабельные области принимать единую конформацию.. Как следствие, пептидные аптамеры могут прочно связывать свои мишени с аффинностями связывания, сравнимыми с показателями антител (наномолярный диапазон).
Каркасы пептидных аптамеров обычно представляют собой небольшие упорядоченные растворимые белки. Первым каркасом, который все еще широко используется, является Escherichia coli тиоредоксин, продукт гена trxA (TrxA). В этих молекулах один пептид с вариабельной последовательностью отображается вместо мотива Gly-Pro в петле активного сайта TrxA -Cys-Gly-Pro-Cys-. Улучшения TrxA включают замену серинов на фланкирующие цистеины, что предотвращает возможное образование дисульфидной связи в основании петли, введение замены D26A для уменьшения олигомеризации и оптимизацию кодонов для экспрессии в клетках человека. В обзорах 2015 года сообщалось об исследованиях с использованием 12 и 20 других каркасов.
Выбор пептидного аптамера может производиться с использованием различных систем, но наиболее часто используемой в настоящее время является двухгибридная система дрожжей . Пептидные аптамеры также могут быть выбраны из комбинаторных пептидных библиотек, созданных с помощью фагового дисплея и других технологий поверхностного дисплея, таких как дисплей мРНК, дисплей рибосом, бактериальный дисплей. и дрожжевой дисплей. Эти экспериментальные процедуры также известны как биопэннинг. Среди пептидов, полученных из биопэннингов, мимотопы можно рассматривать как разновидность пептидных аптамеров. Все пептиды, отобранные из комбинаторных пептидных библиотек, были сохранены в специальной базе данных под названием MimoDB.
. Был продемонстрирован отбор регулируемых лигандом пептидных аптамеров (LiRPA). Путем отображения пептидов из 7 аминокислот из нового каркасного белка на основе структуры тример FKBP-рапамицин-FRB взаимодействие между рандомизированным пептидом и молекулой-мишенью можно контролировать с помощью небольшой молекулы Рапамицин или неиммуносупрессивные аналоги.
Белок Affimer, эволюция пептидных аптамеров, представляет собой небольшой, высокостабильный белок, сконструированный для отображения пептида петель, которая обеспечивает поверхность связывания с высоким сродством для конкретного целевого белка. Это белок с низкой молекулярной массой, 12–14 кДа, происходящий из семейства ингибиторов цистеиновой протеазы из цистатинов.
. Каркас Affimer представляет собой стабильный белок, основанный на белковой складке цистатина. Он отображает две пептидные петли и N-концевую последовательность, которая может быть рандомизирована для связывания различных целевых белков с высокой аффинностью и специфичностью, аналогичной антителам. Стабилизация пептида на белковом каркасе ограничивает возможные конформации, которые может принимать пептид, тем самым увеличивая аффинность и специфичность связывания по сравнению с библиотеками свободных пептидов.
Белковый каркас Affimer был первоначально разработан в MRC Cancer Cell Unit в Кембридже, а затем в двух лабораториях Университета Лидса. Технология Affimer была коммерциализирована и разработана Avacta Life Sciences, которая разрабатывает ее в качестве реагентов для исследований и терапевтических применений.
X-аптамеры - это аптамеры нового поколения, разработанные для улучшения связывания и универсальности обычных аптамеров на основе ДНК / РНК. X-Аптамеры созданы с использованием комбинации природных и химически модифицированных нуклеотидов ДНК или РНК. Модификации оснований позволяют включать различные функциональные группы / небольшие молекулы в X-аптамеры, открывая широкий спектр применений и повышая вероятность успешного связывания по сравнению со стандартными аптамерами. Тиофосфатные модификации основной цепи в выбранных положениях повышают стабильность нуклеаз и сродство связывания без ущерба для специфичности.
X-аптамеры могут исследовать новые функции, используя новый процесс выбора. В отличие от SELEX, выбор X-аптамера не основан на многократных повторных циклах ПЦР-амплификации, а скорее включает двухэтапный процесс обнаружения на основе гранул. В процессе первичного отбора создаются комбинаторные библиотеки, в которых каждая гранула будет содержать примерно 10 ^ 12 копий одной последовательности. Гранулы действуют как носители, где связанные последовательности в конечном итоге отделяются в раствор. В процессе извлечения вторичного раствора каждая цель будет использоваться для индивидуального извлечения связывающих последовательностей из раствора. Связывающие последовательности амплифицируются, секвенируются и анализируются. Затем можно синтезировать и охарактеризовать последовательности, обогащенные для каждой мишени.
AptaBiD или Aptamer-Facilitated Biomarker Discovery - это технология для биомаркера открытие. AptaBiD основан на многократной генерации аптамера или пула аптамеров для дифференциальных молекулярных мишеней на клетках, что облегчает экспоненциальное обнаружение биомаркеров. Он включает три основных этапа: (i) дифференциальный многоэтапный отбор аптамеров для биомаркера клеток-мишеней; (ii) выделение биомаркеров из клеток-мишеней на основе аптамера; и (iii) масс-спектрометрия идентификация биомаркеров. Важной особенностью технологии AptaBiD является то, что она производит синтетические аффинные зонды (аптамеры) одновременно с открытием биомаркеров. В AptaBiD аптамеры разрабатываются для биомаркеров клеточной поверхности в их естественном состоянии и конформации. Помимо облегчения идентификации биомаркеров, такие аптамеры можно напрямую использовать для выделения клеток, визуализации клеток и отслеживания клеток in vivo. Их также можно использовать для модулирования активности клеточных рецепторов и доставки в клетки различных агентов (например, миРНК и лекарств).
Аптамеры могут использоваться в:
Аптамеры также были против нескольких патогенов, как бактериальных, так и вирусных, включая вирусы гриппа A и B, респираторно-синцитиальный вирус (RSV) и SARS коронавирус (SARS-CoV) в различных экспериментальных условиях.
Аптамеры обладают врожденной способностью связываться с любой молекулой, на которую они нацелены, включая раковые клетки и бактерии. Связанные с мишенью аптамеры подавляют ее активность. Аптамеры страдают двумя проблемами, ограничивающими их эффективность. Во-первых, связи, которые они образуют с молекулами-мишенями, обычно слишком слабы, чтобы быть эффективными, а во-вторых, они легко перевариваются ферментами.
Добавление неестественного основания к стандартному аптамеру может увеличить его способность связываться с молекулами-мишенями. Второе добавление в виде «мини-ДНК шпильки» дает аптамеру стабильную и компактную структуру, устойчивую к перевариванию, продлевая срок его службы с часов до дней.
Аптамеры с меньшей вероятностью вызывают нежелательные иммунные реакции чем антитела.
Способность аптамеров обратимо связывать молекулы, такие как белки, вызвала растущий интерес к их использованию для облегчения контролируемого высвобождения терапевтических биомолекул, такие как факторы роста. Это может быть достигнуто путем настройки силы сродства для пассивного высвобождения факторов роста наряду с активным высвобождением с помощью таких механизмов, как гибридизация аптамера с комплементарными олигонуклеотидами или разворачивание аптамера за счет силы клеточной тяги.
Аптамеры были использованы для создания функций горячего старта в ферментах ПЦР для предотвращения неспецифической амплификации во время настройки и начальные фазы ПЦР реакций.
