Войти
| Средний домен летального фактора сибирской язвы | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 Рентгеновская кристаллическая структура летального фактора сибирской язвы, связанного с низкомолекулярным ингибитором, bi -mfm3, 3- {5- [5- (4-хлорфенил) фуран-2-илметилен] -4-оксо-2-тиоксотиазолидин-3-ил} пропионовая кислота. | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Symbol | Anthrax-tox_M | ||||||||
| Pfam | PF09156 | ||||||||
| InterPro | IPR015239 | ||||||||
| SCOPe | 1j7n / SUPFAM | ||||||||
| суперсемейство OPM | 35 | ||||||||
| |||||||||
| Концевые N- и C-концевые домены летального фактора сибирской язвы | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
 кристаллическая структура летального фактора сибирской язвы в комплексе с тиоацетил-тир-промет-амидом, металлхелатирующим низкомолекулярный ингибитор пептидила | |||||||||
| Идентификаторы | |||||||||
| Символ | ATLF | ||||||||
| Pfam | PF07737 | ||||||||
| InterPro | IPR014781 | ||||||||
| MEROPS | M34 | ||||||||
| SCOPe | 1pwq / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
| LF-субъединица токсина сибирской язвы | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Идентификаторы | |||||||||
| Символ | Anthrax_toxA | ||||||||
| Pfam | PF03497 | ||||||||
| SCOPe | 1jky / SUPFAM | ||||||||
| |||||||||
Рис. 1. Электронная микрофотография бактерии, вызывающей сибирскую язву, Bacillus anthracis.Токсин сибирской язвы представляет собой три- белок экзотоксин, секретируемый вирулентными штаммами бактерии, Bacillus anthracis - возбудителя сибирской язвы. Токсин был впервые обнаружен Гарри Смитом в 1954 году. Токсин сибирской язвы состоит из связывающего клетки белка, известного как защитный антиген (PA), и двух компонентов фермента, называемых фактором отека (EF) и летальный фактор (LF). Эти три белковых компонента действуют вместе, чтобы передать свои физиологические эффекты. Собранные комплексы, содержащие компоненты токсина, подвергаются эндоцитозу. В эндосоме ферментные компоненты токсина перемещаются в цитоплазму клетки-мишени. Попадая в цитозоль, ферментные компоненты токсина нарушают различные функции иммунных клеток, а именно передачу сигналов и миграцию клеток. Токсин может даже вызывать лизис клеток, как это наблюдается для клеток макрофагов. Токсин сибирской язвы позволяет бактериям уклоняться от иммунной системы, размножаться и в конечном итоге убивать животное-хозяина. Исследования токсина сибирской язвы также дают представление о генерации макромолекулярных ансамблей, а также о транслокации белков, порообразовании, эндоцитозе и других биохимических процессы.
Сибирская язва - это заболевание, вызываемое Bacillus anthracis, спорообразующей грамположительной палочковидной бактерией (рис. 1). Летальность заболевания обусловлена двумя основными факторами вирулентности бактерии: (i) капсулой полиглутаминовой кислоты, которая является анти- фагоцитарной, и (ii) трехкомпонентным белковым токсином, называется токсином сибирской язвы. Токсин сибирской язвы представляет собой смесь трех компонентов белка : (i) защитный антиген (PA), (ii) фактор отека (EF) и (iii) летальный фактор (ЛФ).
Каждый отдельный белок токсина сибирской язвы нетоксичен. Симптомы токсичности не наблюдаются при индивидуальном введении этих белков лабораторным животным. Совместное введение PA и EF вызывает отек, а совместное введение PA и LF приводит к летальному исходу. Первая комбинация называется отечным токсином, а вторая комбинация - летальным токсином. Таким образом, проявление физиологических симптомов в любом случае требует ПА.
Требование PA, наблюдаемое в экспериментах на животных моделях, демонстрирует общую парадигму для бактериальных токсинов, называемую парадигмой A / B. Компонент A является ферментативно активным, а компонент B является компонентом связывания клеток. Токсин сибирской язвы имеет форму A 2 B, где два фермента, EF и LF, являются компонентами A, а PA - компонентом B. Таким образом, PA действует как троянский конь, который переносит EF и LF через плазматическую мембрану в цитозоль, где они могут затем катализировать реакции, нарушающие нормальную физиологию клетки.
Схема действий секретируемых токсинов сибирской язвы Для функционирования белковые компоненты токсина сибирской язвы должны собираться в комплексы голотоксина. Чтобы LF и EF функционировали внутри клетки-мишени, они должны локализоваться в клетке и проникать в ее цитоплазму. Посредством ряда шагов PA может перемещать EF и LF в клетку (рис. 2). Этот процесс начинается, когда форма PA 83 кДа, называемая PA83, связывается с. Существует два известных гомологичных рецептора, которые связываются с PA83, которые называются опухолевым эндотелием маркером-8 (TEM8 ) и капиллярным белком морфогенеза. (CMG2 ). Затем фрагмент 20 кДа (PA20) отщепляется от аминоконца PA83 мембранными эндопротеазами из семейства фуринов. Когда PA20 диссоциирует, оставшаяся часть PA, связанная с рецептором, называемая PA63, может собираться в гептамерный или октамерный кольцевой олигомер. Этот кольцеобразный олигомер часто называют пре-поровой (или преканальной) формой PA, поскольку позже на своем пути он станет порой (или каналом) транслоказы. Поверхность препорового олигомера, которая подверглась воздействию при высвобождении фрагмента PA20, может затем связываться с LF и EF. Гептамерная и октамерная формы олигомера PA могут затем связываться с тремя или четырьмя молекулами EF и / или LF соответственно. Затем клетка эндоцитозирует эти собранные комплексы и переносит их в кислый отсек клетки. Низкое pH, встречающееся в эндосоме, заставляет пре-канал PA63 превращаться в катион-селективный канал. EF и LF перемещаются по каналу за счет градиента pH, позволяя факторам ферментов проникать в цитозоль.
Попав в цитозоль, EF и LF затем переносят
Таким образом, синергетический эффект этих трех белков приводит к гибели клеток из-за каскада событий, которые позволяют белкам проникать в клетку и нарушать клеточную функцию.
Механизм действия токсина сибирской язвы является результатом молекулярных структур трех токсиновых белков в сочетании с биомолекулами клетки-хозяина. Молекулярные взаимодействия становятся очевидными после выполнения подробного анализа структур PA, EF, LF и клеточных рецепторов (ANTXR1 и ANTXR2 ). Структуры молекул токсина (рис. 3–5), рецептора и комплексов молекул - все это позволило понять синергетические действия этих белков. Анализ сайтов связывания и конформационных изменений дополнил структурные исследования, прояснив функции каждого домена PA, LF и EF, как кратко обрисовано в таблице 1.
Структура PA была определена в первую очередь ( Рис.3). Эта структура и структура его клеточного рецептора проливают свет на специфичность распознавания и связывания. Эта специфичность PA и рецептора CMG2 (аналогично интегинам типа I) обусловлена взаимодействиями через сайт зависимой от ионов металла адгезии (MIDAS), гидрофобную бороздку и выступ β-шпильки. Все это способствует тесному взаимодействию, при котором большая часть поверхности белка на CMG2 (и TEM8) скрывается.
Ленточная диаграмма гептамера PA 63, образующего препоры. Petosa et al.. решила структуру гептамера PA63 при 4,5 Å (0,45 нм). Структура, которую они решили, была не связанной с мембраной пре-порой, конформацией гептамера до того, как комплекс расширит β-ствол через плазматическую мембрану, чтобы перемещать LF и EF в цитозоль.
Гептамеризации и образованию пор стерически препятствует фрагмент PA20, но когда он удаляется с верхней части мономера, быстро образуется пре-пора. Образование гептамера не вызывает серьезных изменений в конформации каждого отдельного мономера, но при объединении более 15400 Ų (154 нм) поверхности белка скрывается. Эта скрытая поверхность состоит в основном из полярных или заряженных боковых групп из доменов 1 и 2.
PA также образует октамерную предканальную структуру. Было показано, что октамерная форма более термостабильна, чем гептамерная форма, и, следовательно, октамерный олигомер может сохраняться в плазме хозяина во время инфекции сибирской язвы.
преканальный октамер PA63 (3HVD) Во время олигомеризации PA63, молекулы EF и / или LF быстро и одновременно связываются с преканалом PA. Это связывание происходит потому, что после удаления домена PA20 открывается большая гидрофобная поверхность на домене 1 PA63. Домен 1 обеспечивает большую поверхность, которая взаимодействует с N-концом EF и LF, которая почти полностью гомологична для первых ~ 36 остатков и аналогична по третичной структуре для первых ~ 250 остатков. Исследования области связывания LF и EF показали, что большая площадь поверхности контактирует с доменом 1 двух соседних молекул PA63, когда они находятся в конформации гептамера. Эта большая область связывания объясняет, почему предыдущие исследования могли связывать только до трех молекул гептамера PA63. Сокристаллическая структура октамера PA в комплексе с N-концевым LF показала, что связывающее взаимодействие фактически представляет собой два прерывистых сайта. Один сайт, названный C-концевым подсайтом, напоминает классическую «горячую точку» с предсказанными солевыми мостиками и электростатическими взаимодействиями. Другой сайт, называемый субсайтом альфа-зажима, представляет собой глубокую щель, которая неспецифически связывает N-концевую альфа-спираль и короткую бета-цепь LF, направляя N-конец субстрата к просвету преканала PA. Таким образом, альфа-зажим способствует транслокации белка, неспецифическому связыванию и последующему разворачиванию вторичной структуры по мере ее разворачивания из субстрата. Сайт связывания LF / EF в настоящее время используется для доставки терапевтических средств через слитые белки.
После образования препоры и присоединения LF и / или EF гептамер мигрирует на липидный слой, где он быстро эндоцитозируется. Эндоцитоз возникает в результате серии событий. Это начинается, когда CMG2 или TEM8 пальмитоилированы, что ингибирует ассоциацию рецептора с липидными рафтами. Это препятствует эндоцитозу рецептора до того, как РА83 будет расщеплен и до того, как LF или EF смогут связываться с гептамером. Реассоциация рецептора с холестерином и микродоменами, богатыми гликосфиголипидами (липидными рафтами ), происходит, когда PA63 связывается с рецептором и гептамеризируется. Как только рецептор и PA возвращаются на липидный слой, E3-убиквитинлигаза Cb1 убиквитинирует цитоплазматический хвост рецептора, передавая сигнал рецептору и связанным с ним токсиновым белкам для эндоцитоза. Динамин и Eps15 необходимы для возникновения этого эндоцитоза, что указывает на то, что токсин сибирской язвы проникает в клетку по клатрин -зависимому пути.
Как обсуждалось, каждая молекула взаимодействует с несколько других, чтобы вызвать эндоцитоз токсина сибирской язвы. Оказавшись внутри, комплекс переносится в кислый отсек, где гептамер, все еще находящийся в немембранной пре-поровой конформации, подготавливается для транслокации EF и LF в цитозоль.
На первый взгляд, первичная последовательность PA не похожа на последовательность трансмембранного белка. На графике гидрофобности отсутствуют какие-либо закономерности, которые являются общими для возможных трансмембранных доменов. Структуры других мультимерных мембранных белков (таких как дифтерийный токсин ) дают ответ на вопрос о том, как PA удается проникать через мембрану. Считается, что PA действует подобно этим мультимерным мембранным белкам, которые образуют β-бочки, состоящие из участков как полярных, так и неполярных аминокислот каждого мономера.
Мотив греческого ключа. формирование поры β-цилиндра облегчается падением pH. Чтобы сформировать цилиндр, когда pH падает, домен 2 PA63 должен претерпеть наибольшее изменение конформации. Изучив структуру домена 2 (рис. 7), можно увидеть, что этот домен содержит мотив с греческим ключом (золотая часть на рис. 7). Общая схема мотива с греческим ключом показана на рис. 8. К греческому ключу в домене 2 прикреплена большая неупорядоченная петля. Необходимость этой петли в порообразовании показана с помощью мутагенеза и протеолиза петли химотрипсином. Дополнительные электрофизиологические измерения замен цистеина помещают аминокислоты этой петли внутрь просвета поры, в которую вставлена мембрана. Неупорядоченная петля в домене 2 также имеет паттерн чередования гидрофобных и гидрофильных аминокислот, который является паттерном, сохраняющимся в покрывающих мембрану частях поринов. Единственная проблема заключается в том, что петля недостаточно велика, чтобы охватить мембрану β-цилиндра. Встраивание в мембрану могло произойти только при дополнительных конформационных изменениях. Большое конформационное изменение происходит там, где разворачивается мотив греческого ключа, образуя β-шпильку, которая выступает вниз в мембрану и образует β-бочку с другими 6 мономерами комплекса (рисунки 9a и 9b). Конечная пора имеет диаметр 12 Å (1,2 нм), что соответствует теоретическому значению этой модели.
Эта модель потребует значительных конформационных изменений в домене 2 наряду с разрывом многих водородных связей, как в греческой модели. -ключевой мотив отслаивается от центра домена. Petosa et al. предложил модель того, как это происходит. Встраивание ключевых мотивов PA греческого происхождения в мембрану происходит при подкислении гептамера. На искусственных двойных слоях это происходит, когда pH снижается с 7,4 до 6,5, что позволяет предположить, что триггером введения является титрование гистидинов. Это действительно соответствует последовательности PA, поскольку домен 2 содержит некоторое количество гистидинов (показано звездочками на рисунке 9a). В неупорядоченной петле обнаружены три остатка гистидина, один из которых находится с гистидином с греческим ключом в кластере полярных аминокислот. Этот кластер (включая два гистидина, три аргинина и один глутамат) встроен в верхнюю часть ключевого греческого мотива, поэтому легко увидеть, что протонирование этих гистидинов разрушило бы кластер. Кроме того, другой гистидин расположен в основании ключевого греческого мотива вместе с рядом гидрофобных остатков (в зеленом сегменте на фигурах 7 и 9a). При pH 7,4 этот сегмент упорядочен, но при выращивании кристаллов при pH 6,0 он становится неупорядоченным. Этот переход от порядка к беспорядку является начальным этапом введения мембраны ПА.
PA эндоцитозируется как растворимый гептамер, присоединенный к его рецепторам, с LF или EF, присоединенными к гептамеру в качестве груза. Первым шагом после эндоцитоза является закисление эндоцитотического пузырька. Подкисление играет две роли в продолжительности жизни токсина. Во-первых, это помогает ослабить плотный захват рецептора CMG2 или TEM8 на PA, облегчая формирование пор (разные рецепторы допускают введение при немного другом pH). Во-вторых, снижение pH приводит к тому, что неупорядоченная петля и мотив греческого ключа в домене PA 2 сворачиваются из препоры гептамера и внедряются через стенку кислой везикулы, что приводит к образованию пор (рисунки 7–9)..
Santelli et al. объяснили больше о процессе после того, как они определили кристаллическую структуру комплекса PA / CMG2. Структура этого комплекса показывает связывание CMG2 как доменами 2, так и 4 PA. Это взаимодействие демонстрирует меньшую свободу раскрытия греческого ключа. Дальнейший анализ показывает, что семь из девяти гистидинов в PA находятся на интерфейсе домен 2 / домен 4. Протонирование этих гистидинов приводит к тому, что домены разделяются в достаточной степени, чтобы позволить греческому ключу выскочить и помочь сформировать β-шпильку, участвующую в вставке. Кроме того, когда PA связывается с CMG2, вставка больше не происходит при pH 6,5, как при вставке в искусственную мембрану. Вместо этого для введения в естественные клетки требуется pH 5,0. Было объяснено, что это различие является результатом наличия кармана рядом с мотивом MIDAS в CMG2. Этот карман содержит гистидин, похороненный на дне, где прикрепляется домен 2. Этот гистидин протонируется при более низком pH и увеличивает стабильность PA. Эта дополнительная стабильность не дает греческому ключу двигаться до тех пор, пока не будут выполнены более кислые условия. Все эти гистидины работают вместе, чтобы предотвратить преждевременное внедрение гептамера до возникновения эндоцитоза.
Сантелли и его коллеги (рис. 10) также построили гипотетическую структуру структуры PA / CMG2, встроенной в мембрану. Эта модель показывает, что β-бочка имеет длину около 70 Å (7 нм), 30 Å (3 нм) из которых охватывают мембрану, а зазор 40 Å (4 нм) фактически заполнен остальной внеклеточной частью рецептор CMG2 (~ 100 остатков). CMG2 обеспечивает дополнительную поддержку пор.
Диаграмма транслокации белка. Несколько недавних исследований демонстрируют, как пора PA63 позволяет EF и LF проникать в цитоплазму, когда ее просвет настолько мал. Просвет поры PA63 составляет всего 15 Å (1,5 нм) в поперечнике, что намного меньше диаметра LF или EF. Транслокация происходит в результате серии событий, которые начинаются в эндосоме, когда она подкисляется. LF и EF чувствительны к pH, и при падении pH их структуры теряют стабильность. Ниже pH 6,0 (pH в эндосоме) как LF, так и EF становятся неупорядоченными расплавленными глобулами. Когда молекула находится в этой конформации, N-конец высвобождается и втягивается в пору за счет протонного градиента и положительного трансмембранного потенциала. Кольцо из семи фенилаланинов на эндосомной стороне рта поры (фенилаланиновый зажим) помогает разворачиванию LF или EF, взаимодействуя с гидрофобными остатками, обнаруженными в LF или EF. Затем протонный градиент начинает пронизывать белок через пору. Механизм шнуровки приводится в движение градиентом, но для храпового движения требуется фенилаланиновый зажим. Первые 250 остатков EF и LF имеют нерегулярную чередующуюся последовательность основных, кислотных и гидрофобных остатков. Взаимодействие между зажимом фенилаланина и состоянием протонирования вызывает эффект храповика, который управляет белком, хотя до тех пор, пока достаточное количество не пересечется в цитоплазму, чтобы протащить остаток через пору, когда N-конец перегибается (Рис. 11).
